Robert Langdon (Tom Hanks), un brillante professore di simbologia, viene convocato con urgenza dal Vaticano per decifrare il significato di un simbolo recapitato insieme a una lettera minatoria che sembra ricondurre alla setta degli "Illuminati", una società segreta il cui fine è la distruzione totale della Chiesa Cattolica, costituita da scienziati ed artisti. Tutto questo avviene in un momento estremamente delicato per la Chiesa Cattolica, quello della sede vacante, durante il quale si svolge il Conclave per l'elezione del nuovo Papa. Infatti sono stati rapiti ben quattro cardinali, tra l'altro i "preferiti" (i più probabili aspiranti al seggio pontificio): il cardinale tedesco Ebner, lo spagnolo Guidera, il cardinale di colore Lamasse e l'italiano Aldo Baggia. In un video il misterioso rapitore minaccia di ucciderne uno ogni ora a partire dalle 20:00, per poi distruggere l'intera Chiesa a mezzanotte.
Langdon, aiutato dalla scienziata italiana Vittoria Vetra (Ayelet Zurer), dal capo delle Guardie Svizzere Richter (Stellan Skarsgård) e dal comandante della Gendarmeria Vaticana Olivetti (Pierfrancesco Favino) si trova a condurre una caccia senza quartiere all'assassino, tra funamboliche corse tra le strade di Roma e criptici indizi celati tra statue e monumenti, per evitare che gli Illuminati portino a termine il loro piano di distruzione dello Stato Vaticano attraverso l'esplosione di un cilindro di antimateria appositamente trafugato dal CERN e nascosto nel cuore della Basilica di San Pietro.
Il film mostra il percorso di Langdon attraverso gli indizi che scopre man mano. Molto presto Langdon capisce che ogni luogo dove verrà ritrovato una vittima sarà caratterizzato dalla presenza di un'opera di Gianlorenzo Bernini (membro degli Illuminati), sia essa una scultura o una fontana. Il primo cardinale si trova nella "tomba di Santi" (vale a dire la Cappella Chigi nella chiesa di Santa Maria del Popolo). Quando Langdon, che inizialmente pensava che sarebbe stato ucciso nel Pantheon, realizza che il porporato verrà ucciso lì, è ormai troppo tardi: è già stato legato e soffocato ed è ricoperto dai topi. Il suo corpo è stato marchiato con la scritta "earth" (terra), uno dei quattro elementi iniziali, e il cardinale si trova nei sotterranei della Cappella Chigi.
Dopo questa morte, che la Chiesa non rende pubblica, Langdon nota come un angelo indichi verso ovest: leggendo una cartina geografica si accorgerà che l'unica chiesa che si trova in quella direzione è la Basilica di San Pietro. Arrivano in Piazza San Pietro in tempo, ma scoppia una lite fra alcuni fedeli presenti in piazza e ad una bambina cade per terra la sua bambola di pezza. Quando la raccoglie, nota che è piena di sangue. Infatti, al centro della piazza, nei pressi dell'obelisco di San Pietro, giace il secondo cardinale (ai piedi dell'obelisco vi è un bassorilievo del Bernini rappresentante il vento). Vittoria tenta di praticargli la respirazione bocca a bocca, ma quando soffia, un mucchio di sangue schizza in faccia a Langdon: il cardinale è morto; gli sono stati perforati i polmoni e sul petto ha un marchio, "air" (aria), un altro degli elementi iniziali.
Per capire dove si trova il terzo cardinale, Langdon ha bisogno di consultare di nuovo dei documenti negli archivi Vaticani, come nel caso del primo cardinale. Mentre si trova lì, viene tolta la corrente a quel settore e non c'è ossigeno. Per fortuna riesce a far cadere uno scaffale contro il vetro che, dopo qualche secondo, si rompe e gli permette di tornare a respirare. Scopre con qualche difficoltà che il prossimo luogo coinvolto per l'omicidio è la Chiesa di Santa Maria della Vittoria (dove si trova l'Estasi di Santa Teresa del Bernini): ci si reca subito e trova il terzo cardinale, appeso con delle catene su di una catasta infuocata e marchiato con "fire" (fuoco) sul petto. È accompagnato dalla Gendarmeria Vaticana, ma l'assassino ha una pistola con silenziatore, che usa per uccidere tutti quelli che trova. Intanto Langdon stacca la catena, ma non avendo più chi gli tiene ferma la scala, la fa scivolare, lasciando cadere il cardinale nel fuoco che, in pochi secondi, lo arde completamente.
Il quarto luogo coinvolto è la Fontana dei Quattro Fiumi. Arriva in tempo anche qui, accompagnato da tre carabinieri che l'assassino fredda liquidandoli in poco tempo. Alle 23 esatte il cardinale Aldo Baggia, il quarto, viene gettato nella fontana. Langdon si tuffa gridando per avere aiuto. Il cardinale è legato ad una barella, per cui non può riemergere. Sta per smettere di respirare, quando Langdon si accorge che c'è un tubo sul fondo della fontana. Lo infila in bocca al cardinale, che può così respirare. Si tuffano nella fontana anche altre persone, cosicché il cardinale possa essere tirato fuori dalla fontana. È marchiato con la parola "water" (acqua).
L'ultima chiesa sarà quella dove si riunivano in gran segreto gli Illuminati nei secoli precedenti: Castel Sant'Angelo, a pochi passi dal Vaticano. I protagonisti lo raggiungono in breve e scoprono anche un passaggio che conduce direttamente in Vaticano. Lì riescono a sventare l'omicidio del Camerlengo Patrick McKenna (Ewan McGregor): egli giace a terra, con il petto marchiato a fuoco con il simbolo delle chiavi di San Pietro rovesciate, mentre Richter è davanti a lui con una pistola in pugno; Richter viene ucciso dalle guardie, mentre Langdon e gli altri riescono a ritrovare la bomba, che si trovava nella tomba di San Pietro, il fondatore della chiesa. La bomba sta quasi per scoppiare e la dottoressa Vetra asserisce che non è possibile disinnescarla senza rischiare di farla esplodere: il Camerlengo allora, che in gioventù si era arruolato nell'aviazione italiana, con un atto di grande coraggio decolla a bordo di un elicottero e, a rischio della sua stessa vita, lo porta in alta quota per poi inserire l'autopilota e paracadutarsi solo quando il velivolo è a debita distanza da Piazza San Pietro, gremita di fedeli.
Dopo aver fatto esplodere la bomba in aria, tutto sembra risolto, ma al professor Langdon qualcosa non torna, e quindi visionando le registrazioni effettuate dalla sicurezza dentro la stanza del Santo Padre, scoprono che il complotto era stato organizzato dal Camerlengo (che aveva anche avvelenato a suo tempo il Papa, suo padre adottivo): Richter aveva capito tutto e si era introdotto nella sua stanza per smascherarlo e accusarlo degli omicidi, ma il Camerlengo si era marchiato a fuoco da solo il proprio petto; Richter, incredulo, non era riuscito a professare la propria innocenza in tempo quando le guardie, irrompendo nella sala, lo avevano abbattutto vedendolo con la pistola in mano e credendolo il responsabile di tutto. Il Camerlengo, che alcuni cardinali avrebbero voluto eleggere Papa per via del suo eroismo, appena viene smascherato preferisce darsi fuoco e morire in questo modo. L'indomani mattina viene eletto Papa il cardinale Aldo Baggia (l'unico dei "preferiti" sopravvissuto agli omicidi della notte precedente), con il nome di Luca I: in questo modo egli spera di conciliare una volta per tutte scienza e fede (l'evangelista Luca era un medico). Langdon, oltre a ricevere la gratitudine di tutti, ottiene finalmente in prestito un prezioso e antico libro, in possesso della Biblioteca Vaticana, che gli servirà per le sue ricerche.
